REPLI-g單細(xì)胞試劑盒

從單個細(xì)胞或有限的樣品材料中進(jìn)行高度均勻的全基因組擴(kuò)增（WGA）

• 單細(xì)胞材料的WGA具有完整的基因組覆蓋范圍
• 由于MDA技術(shù)，基因組基因座的無偏擴(kuò)增
• 經(jīng)過優(yōu)化，可與包括NGS在內(nèi)的新技術(shù)配合使用
• 一致的產(chǎn)量高達(dá)40 µg（平均產(chǎn)物長度> 10 kb）
• 用于癌癥研究，干細(xì)胞研究或宏基因組學(xué)的新型工具

使用創(chuàng)新儀器（例如下一代測序（NGS）平臺）進(jìn)行生物樣品的DNA序列分析和基因分型通常受限于少量樣品。REPLI-g單細(xì)胞試劑盒專門設(shè)計用于從單細(xì)胞（1至<1000個細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞）或純化的基因組DNA中均勻擴(kuò)增基因組DNA，并具有完整的基因組覆蓋范圍。其他協(xié)議也可用于新鮮或干燥血液或新鮮或冷凍組織。的緩沖液和試劑經(jīng)過*的受控去污程序，以避免擴(kuò)增污染性DNA，從而確保每次都獲得高度可靠的結(jié)果。創(chuàng)新的多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)可實現(xiàn)具有可忽略的序列偏倚且無基因組缺失的基因組準(zhǔn)確擴(kuò)增。

REPLI-g單細(xì)胞試劑盒

REPLI-g單細(xì)胞試劑盒適用于分子生物學(xué)應(yīng)用。本產(chǎn)品不用于診斷，預(yù)防或治療疾病。

產(chǎn)品詳情

性能

完整的基因組覆蓋范圍，非常適合NGS和其他下游應(yīng)用

使用REPLI-g單細(xì)胞試劑盒擴(kuò)增的DNA的平均產(chǎn)物長度> 10 kb，并具有大的基因組覆蓋范圍。它已通過眾多下游分析進(jìn)行了測試，并非常適用于這些分析，包括下一代測序（NGS），陣列比較基因組雜交（aCGH）和基于實時PCR的應(yīng)用（請參見表2）。由于不需要單獨的基于PCR的擴(kuò)增步驟，因此與基于PCR的方法相比，REPLI-g全基因組擴(kuò)增和文庫制備所需的動手時間更少，讀取長度更長（請參見“使用與基于PCR的方法相比，REPLI-g擴(kuò)增的DNA需要更少的動手時間并產(chǎn)生更多的序列信息“）。高質(zhì)量的，可比的NGS結(jié)果表明，純化的基因組DNA或REPLI-g單細(xì)胞擴(kuò)增的DNA均可實現(xiàn)高百分比的序列覆蓋率和非常低的錯誤率，包括僅從單個細(xì)菌細(xì)胞開始的情況（見圖） “可比NGS結(jié)果”）。這些發(fā)現(xiàn)是通過寬范圍的標(biāo)記覆蓋所有人類常染色體和X染色體的全面分析強(qiáng)調(diào)，具有3個不同的獨立的實驗表明DNA被成功地從基因組的所有區(qū)域擴(kuò)增無單次輟學(xué)（見圖“完整的基因組覆蓋范圍”）。

REPLI-g單細(xì)胞試劑盒優(yōu)于其他供應(yīng)商的試劑盒

其他供應(yīng)商通常使用的基于PCR的WGA方法導(dǎo)致短片段被PCR引物序列終止，這可能會影響下游過程（例如，下一代測序；請參見圖“使用REPLI-g擴(kuò)增的DNA進(jìn)行的下一代測序需要更少的動手時間，比基于PCR的方法產(chǎn)生更多的序列信息”）。基于PCR的WGA可能導(dǎo)致容易出錯的擴(kuò)增，例如，導(dǎo)致單個堿基對突變，STR收縮和擴(kuò)增，并且由于使用低保真酶Taq而導(dǎo)致基因座的偏倚和代表性不足DNA聚合酶。相比之下，REPLI-g單細(xì)胞試劑盒可在整個基因組中提供高度均勻的擴(kuò)增，且擴(kuò)增過程中基因座偏向小。使用每種試劑盒*的單細(xì)胞擴(kuò)增方案，測試了四種WGA試劑盒（包括REPLI-g單細(xì)胞試劑盒）和2種利用MDA技術(shù)的2種基于PCR的方法的序列表示和基因座缺失。與REPLI-g單細(xì)胞試劑盒不同，使用其他供應(yīng)商的試劑盒分析的單細(xì)胞通常無法完整無偏地顯示序列（請參見“從單細(xì)胞無偏DNA擴(kuò)增”圖）。

原理

REPLI-g單細(xì)胞試劑盒包括REPLI-g sc聚合酶，這是創(chuàng)新的高保真酶Phi 29聚合酶的優(yōu)化配方，可使用多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)擴(kuò)增復(fù)雜的基因組DNA，并進(jìn)行溫和的堿性孵育以確保非常低的DNA/片段化或無堿基位點的產(chǎn)生。它經(jīng)過專門設(shè)計，可從單個細(xì)胞（例如分離的腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌）提供高產(chǎn)量的擴(kuò)增DNA（請參見表1）。此外，它還可以用于各種臨床和非臨床研究樣品以及純化的基因組DNA，同時還可以使用其他方案來處理新鮮或干燥的血液以及新鮮或冷凍的組織。無論模板的起始量如何，典型的DNA產(chǎn)量始終可達(dá)到40 µg，這意味著隨后的遺傳分析無需進(jìn)一步測量DNA濃度即可進(jìn)行。平均產(chǎn)物長度超過10 kb，并且具有完整的基因組覆蓋范圍，確保使用REPLI-g單細(xì)胞試劑盒擴(kuò)增的DNA非常適合眾多下游應(yīng)用，包括下一代測序（NGS），基于陣列的比較基因組雜交（陣列CGH） ），焦磷酸測序和實時PCR分析（表2）。

放大原理

REPLI-g單細(xì)胞試劑盒使用等溫基因組擴(kuò)增，稱為多重置換擴(kuò)增（MDA），涉及隨機(jī)六聚體與變性DNA的結(jié)合，然后在恒定溫度下用優(yōu)化形式的Phi 29聚合酶進(jìn)行鏈置換合成，它具有異常強(qiáng)的股線位移特性。在每條置換的鏈上都可充當(dāng)模板，從而引發(fā)額外的引發(fā)事件，從而可產(chǎn)生高產(chǎn)量的擴(kuò)增DNA（見圖“多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)”）。Phi 29聚合酶是一種噬菌體衍生的酶，是一種具有3'→5'主要核酸外切酶活性（校對活性）的DNA聚合酶，其保真度比Taq高1000倍DNA聚合酶。在*，優(yōu)化的REPLI-g單細(xì)胞緩沖液系統(tǒng)的支持下，Phi 29聚合酶可以輕松解決二級結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾環(huán)），從而防止擴(kuò)增過程中聚合酶的滑動，終止和解離。這樣就可以產(chǎn)生高達(dá)100 kb的DNA/片段，而不會產(chǎn)生序列偏倚（請參見“用Phi 29聚合酶進(jìn)行無偏擴(kuò)增”）。

DNA的細(xì)胞裂解和堿變性

在用于酶促擴(kuò)增程序之前，必須先對基因組DNA進(jìn)行變性，這通常使用苛刻的方法完成，例如在高溫下孵育（熱孵育）或在pH值升高（化學(xué)堿性孵育）的情況下。REPLI-g單細(xì)胞試劑盒使用溫和的堿性孵育，可實現(xiàn)gDNA的細(xì)胞裂解和均勻的DNA變性，而DNA/片段化程度極低或無堿基位點的產(chǎn)生。這導(dǎo)致擴(kuò)增的DNA具有非常高的完整性，并大化了擴(kuò)增片段的長度，因此基因組位點和序列被均勻地表示（參見“熱和堿變性對位點表示的影響”圖）。

有效消除可檢測的DNA污染

所有REPLI-g單細(xì)胞試劑盒組件均經(jīng)過*的受控去污程序，以確保消除所有REPLI-g可擴(kuò)增的污染DNA。通過創(chuàng)新和標(biāo)準(zhǔn)化的程序?qū)⒕彌_液和試劑暴露在紫外線輻射下，以確保不存在任何可檢測到的殘留污染性DNA（請參見“創(chuàng)新性去污程序”圖）。經(jīng)過紫外線處理后，套件會進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，以確保完整的功能。

程序

簡單的一管程序

REPLI-g單細(xì)胞試劑盒使用簡單可靠的方法從單細(xì)胞或有限樣品中獲得準(zhǔn)確的基因組擴(kuò)增。簡單的反應(yīng)設(shè)置和非常短的處理時間（約15分鐘）使這成為一種簡單而可靠的方法（請參見“ REPLI-g單細(xì)胞試劑盒程序”圖）。已開發(fā)出的緩沖液和試劑，可從單個細(xì)胞，有限的組織材料和純化的DNA中獲得高產(chǎn)量的DNA，并具有完整的序列表示和無偏擴(kuò)增（表3）。REPLI-g擴(kuò)增的DNA可以在–20°C下長期保存，不會產(chǎn)生負(fù)面影響（請參見“一致的長期穩(wěn)定性”圖）。